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Primeros reactivo de la polimerización en cadena de Transcriptase del revés del equipo R1011/R1012 de la síntesis del filamento CDNA
Datos del producto:
| Lugar de origen: | China |
| Nombre de la marca: | GDSBio |
| Certificación: | / |
| Número de modelo: | R1011/R1012 |
Pago y Envío Términos:
| Cantidad de orden mínima: | 1box |
|---|---|
| Detalles de empaquetado: | el pequeño paquete o el bulto distribuye u OEM |
| Tiempo de entrega: | días 8work |
| Condiciones de pago: | L/C, D/A, D/P, T/T, Western Union, MoneyGram |
| Capacidad de la fuente: | 100 cajas/cajas por día |
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Información detallada |
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| Gato. No.: | R1011/R1012 | Concentración: | R1011 (20 rxns), R1012 (100 rxns) |
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| Aspecto: | descolorido | Grupo: | Reactivo reversos de la polimerización en cadena de Transcriptase |
| Actividad: | Paso | Capacidad de la amplificación: | / |
| Logo Printing: | Con Logo Printing | Paquete del transporte: | Embalaje |
| Capacidad de producción: | 100 cajas/cajas por día | Condiciones de almacenamiento: | Tienda en -20°C |
| Alta luz: | 20 reactivo reversos de la polimerización en cadena de Transcriptase de los rxns,100 reactivo reversos de la polimerización en cadena de Transcriptase de los rxns,primer equipo de la síntesis del cdna del filamento de 20 rxns |
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Descripción de producto
RT - equipo de la polimerización en cadena
Para el uso de la investigación solamente
Cat No. R1011, 20 rxns
Cat No. R1012, 100 rxns
Componentes del equipo
| Componente | R1011 (20 rxns) | R1012 (100 rxns) |
| M-MLV (200U/μl) | μl 20 | μl 100 |
| RNasin (40U/μl) | μl 12 | μl 60 |
| (Despegue) 15 oligos (los 50μM) | μl 20 | μl 100 |
| Cartilla al azar del hexamer (los 50μM) | μl 20 | μl 100 |
| almacenador intermediario del Primero-filamento 5× | μl 80 | μl 400 |
| ddH ARNasa-libre2 O | 1 ml | 1 ml de × 5 |
| dNTPs (10mM por cada uno) | μl 50 | μl 250 |
Almacenamiento
Todos los componentes del equipo se deben almacenar en -20°C. guardan el ARN del control en -70°C para un almacenamiento más largo.
Descripción
El equipo de RT-PCR se optimiza para sintetizar el cDNA del primero-filamento de polivinílico purificada (A)+ o ARN total. El equipo de RT-PCR para RT-PCR entrega producciones crecientes del cDNA, alta sensibilidad, y transcripciones integrales en un formato conveniente. Usted consigue todos los componentes que usted necesita para la síntesis acertada del cDNA del primero-filamento, ahorrando su tiempo y asegurando su éxito con cada experimento. El equipo Transcriptase reverso es una versión de M-MLV RT que se ha dirigido para reducir actividad de la ARNasa H y para proporcionar estabilidad termal creciente. La enzima se utiliza para sintetizar el cDNA en una gama de temperaturas de 42-55°C, proporcionando especificidad creciente, producciones más altas de cDNA, y un producto más integral que otros transcriptases reversos.
Usos
Primera síntesis del cDNA del filamento para RT-PCR
Construcción de las bibliotecas del cDNA
RT-PCR de un solo paso
Extensión de la cartilla
Notas importantes
Evitar la contaminación de la ribonucleasa
La pureza y la integridad del ARN es esenciales para la síntesis del cDNA integral. El ARN se puede degradar por la ARNasa A, que es un contaminante altamente estable encontrado en cualquier ambiente del laboratorio. Todos los componentes del equipo riguroso se han probado para asegurarse de que son ARNasa-libres. Para prevenir la contaminación el ambiente y los reactivo del laboratorio, todas las soluciones preparadas deben estar libres de RNases. Recomendaciones generales de evitar la contaminación de la ARNasa:
- DEPC-invitación todos los tubos y extremidades de la pipeta que se utilizarán en síntesis del cDNA o para utilizar el labware nucleasa-libre certificado.
- Lleve los guantes al manejar el ARN y todos los reactivo, pues la piel es una fuente común de RNases. Guantes del cambio con frecuencia.
- Utilice los reactivo ARNasa-libres, incluyendo el agua de alta calidad (e.g., agua DEPC-tratada).
- Utilice un inhibidor de la ARNasa, tal como Dongsheng RNasin (#R2011) para proteger el ARN contra la actividad de RNases.
- Guarde todos los componentes del equipo selló firmemente cuando es parado. Guarde todos los tubos se cerró firmemente durante la reacción reversa de la transcripción.
ARN de la plantilla
El ARN celular total aislado con métodos estándar es conveniente para el uso con el equipo. El ARN purificado debe estar libre de las sales, de los iones del metal, del etanol y del fenol a evitar inhibir la reacción de la síntesis del cDNA. Los contaminantes del rastro se pueden quitar por la precipitación del etanol del ARN seguido por dos lavados de la pelotilla con etanol frío del 75%. Para los usos de RT-PCR, el ARN de la plantilla debe estar libre de la contaminación de la DNA. Antes de síntesis del cDNA, el ARN se puede tratar con la ADNasa I para quitar cantidades de rastro de DNA. ADNasa debo ser obtenido por el usuario. Realice siempre una reacción del control (RT-menos) que incluya todos los componentes para RT-PCR a excepción de la enzima reversa del transcriptase.
Digestión de la ARNasa H
La sensibilidad del paso de la polimerización en cadena se puede aumentar (especialmente para las plantillas largas) quitando la plantilla del ARN del cDNA: Molécula híbrida del ARN por la digestión con la ARNasa H después de la síntesis del primero-filamento. La presencia de la ARNasa H durante síntesis del primero-filamento degradará la plantilla mRNA, dando por resultado síntesis integral disminuida del cDNA y producciones disminuidas de cDNA del primero-filamento.
Cartillas
La síntesis del primer cDNA del filamento se puede preparar con (despegue) la cartilla oliga 15, las cartillas al azar o las cartillas gen-específicas.
(Despegue) 15 oligos prepara síntesis del cDNA del polivinílico (A) presente de la cola en el 3' - extremo del mRNA eucariótico. Las cartillas al azar inician síntesis del cDNA de la población total del ARN (rRNA y mRNA). Por lo tanto, usando las cartillas al azar para los primeros resultados de la síntesis del filamento en una mayor complejidad del cDNA generado comparado con (despegue) la cartilla oliga 15. Por consiguiente, la sensibilidad y la especificidad de las reacciones subsiguientes de la polimerización en cadena pueden ser reducidas. Sin embargo, hay varios usos donde está beneficioso utilizar las cartillas al azar, tales como síntesis del cDNA usando mRNAs sin un polivinílico (A) cola, o síntesis del cDNA usando polivinílico (A) - muestras enriquecidas del ARN.
las cartillas Gen-específicas se utilizan para sintetizar el cDNA específico de una piscina del ARN o del mRNA total y se deben obtener por el usuario.
Primero - procedimiento de síntesis del cDNA del filamento
El primer - la reacción del cDNA del filamento se puede realizar como reacción individual o como serie de reacciones paralelas con diversas plantillas del ARN. Por lo tanto, la mezcla de reacción puede ser preparada combinando los reactivo individualmente o una mezcla principal que contiene todos los componentes excepto el ARN de la plantilla puede ser preparada. Dependiendo de la estructura de la plantilla del ARN, los pasos separados para la desnaturalización del ARN y el recocido de la cartilla pueden mejorar resultados de RT-PCR.
Protocolo
I. Primera síntesis del cDNA del filamento
1. Añada los reactivo siguientes en un tubo estéril, nucleasa-libre en el hielo en el orden indicado:
| ARN de la plantilla |
polivinílico (A) mRNA o ARN específico |
1-5 μg |
| Cartilla |
(despegue) cartilla oliga 15 o cartilla al azar del hexamer |
1 μl 1 μl |
| agua DEPC-tratada | al μl 12,4 | |
| Volumen total | μl 12,4 | |
2. Mézclese suavemente, centrifugue brevemente e incube en 70°C para la frialdad mínima 5 en el hielo, hacer girar abajo y colocar el frasco detrás en el hielo.
3. Prepare la mezcla siguiente de la síntesis del cDNA, añada los componentes siguientes en el orden indicado:
| almacenador intermediario del primero-filamento 5× | μl 4 |
| dNTPs (10 milímetros cada uno) | 1 μl |
| RNasin | 0,6 μl |
| M-MLV | 1 μl |
4. Mézclese suavemente y centrifugue brevemente.
5. Para (despegue) 15 oligos, incube para el minuto 60 en 42°C. Para el hexamer al azar la síntesis preparada, incuba para el minuto 60 en 37°C.
6. Termine la reacción calentando en 70°C para 5 mínimos.
El producto reverso de la reacción de la transcripción se puede utilizar inmediatamente en las segundas reacciones de la síntesis del cDNA del filamento o almacenar en -20°C para menos que una semana. Para un almacenamiento más largo, se recomienda -70°C.
II. amplificación de la polimerización en cadena del primer cDNA del filamento
El producto de la primera síntesis del cDNA del filamento se puede utilizar directamente en la polimerización en cadena o el qPCR. El volumen de primera mezcla de reacción de la síntesis del cDNA del filamento no debe comprender más de 1/10 del volumen total de la reacción de la polimerización en cadena. Normalmente, el μl 2 de la primera mezcla de reacción de la síntesis del cDNA del filamento se utiliza como plantilla para la polimerización en cadena subsiguiente en volumen total de 50 μl.
Dongsheng Biotech ofrece diversa serie de productos para ayudarle a alcanzar éxito de la polimerización en cadena. Para las enzimas, nuestra polimerasa de Taq, la polimerasa de DNA del HS Taq, la polimerasa de DNA de la polimerasa, de Pfu de DNA del FS Taq y la polimerasa de DNA de Pfu de la fusión proporcionan de alta fidelidad, eficiente, funcionamiento de la polimerización en cadena de la sensibilidad. También tenemos polimerasa de DNA larga de Taq para el funcionamiento largo de la polimerización en cadena.
