Descripción de producto

Equipo rápido de la preparación de la biblioteca de la DNA para MGI

[Nombre de producto]

Equipo rápido de la preparación de la biblioteca de la DNA para MGI

[Gato. No/espec.]

Rxns KM001-A/24; Rxns KM001-B/96; rxns del saco 6 de la muestra

[Descripción de producto]

Teniendo como objetivo la alto-producción de MGI que ordena la plataforma, este equipo proporciona un esquema de construcción conveniente y universal de la biblioteca de la DNA en un tubo. Combina la reparación y el Uno-tizón del extremo en un paso, y los reactivo se premezclan altamente, acortando grandemente la época de la construcción de la biblioteca y reduciendo el error causado por pasos aburridos. La preparación del extremo, la ligadura del adaptador, la amplificación y la purificación de la DNA doble-trenzada hecha fragmentos se pueden realizar en más o menos de 2 horas. La cuantificación completa de la biblioteca se puede realizar por el método del tinte fluorescente del dsDNA (e.g., Qubit termo Flex Fluorometer) o la polimerización en cadena absoluta de la cuantificación después de diluir la biblioteca a una concentración apropiada.

[Tipo de la muestra]

[Condición de almacenamiento y vida útil]

Todos los reactivo se deben almacenar en el almacenador intermediario de la ligadura de -20°C. son normales para que los cristales se precipiten en las bajas temperaturas, él se deben equilibrar a la temperatura ambiente antes de usar. El producto es válido por 12 meses.

[Componentes]

* si hay más de una muestra, se recomienda la mezcla de la cartilla del adaptador #KM002 y #KM003. Este equipo proporciona un sistema de cartillas.

Nota: gotas recomendadas de la selección: Gotas de la selección Magbeads o de AMPure XP de la DNA de #NC1011 GDSPure.

[Notas]

1. Ofrecemos dos tipos de sistema universal de las cartillas del adaptador (#KM002 y #KM003, comprados por separado), pero los clientes pueden también elegir de otros fabricantes o sintetizar su propio adaptador para el MGI que ordena la plataforma. Demasiado adaptador llevará a la formación de dimero del adaptador, y el adaptador escaso llevará a la salida baja de la biblioteca. Por lo tanto, la concentración apropiada del adaptador determina la concentración y la calidad de la biblioteca. Las concentraciones recomendadas del adaptador para diversas cantidades de entrada de la DNA se muestran en la tabla siguiente:

Concentraciones recomendadas del uso del cuadro 1 de adaptador

* expresado como el ratio del volumen del adaptador al diluyente

2. La enzima usada en la mezcla principal de la polimerización en cadena de la biblioteca DE ALTA FIDELIDAD 2× es una polimerasa de DNA de la familia de B, que tiene 5" - 3" polimerasa y 3" - 5" las actividades del exonuclease, pero carece 5" - 3" las actividades del exonuclease. Tiene capacidad sostenible de alta fidelidad y homogeneidad, y fuerte de la síntesis. El control estricto del número de ciclos de la amplificación es particularmente importante para la salida de la biblioteca. La tabla siguiente muestra el número recomendado de ciclos de la amplificación correspondiente a diversas cantidades de entrada de la DNA:

Número recomendado del cuadro 2 de ciclos de la amplificación correspondiente a diversas entradas de la muestra

Nota: 1. La tabla antedicha muestra los resultados de la prueba usando 150bp la DNA estándar, que está para la referencia solamente.

2. Si se utilizan los conectores incompletos, un número mínimo de los ciclos (1-3) se debe amplificar para obtener una biblioteca completa.

3. Si la calidad de la DNA de la entrada es pobre, o la selección de tamaño se realiza durante la construcción de la biblioteca, el número de ciclos de la amplificación debe ser aumentado apropiadamente.

[Proceso estándar de la construcción de la biblioteca]

Reparación del final

Nota: Si la DNA hecha fragmentos excede el μl 45 antes de que este paso, o el almacenador intermediario sea incompatibles con el almacenador intermediario de la reparación del final, una purificación magnética de la gota se debe realizar primero.

1. Prepare la reacción siguiente en un tubo de la polimerización en cadena de 200 μl:

2. Vórtice suavemente y vuelta abajo brevemente a mezclarse bien, a centrifugar brevemente y para recoger todo el líquido a la parte inferior del tubo.

3. Realice la reacción siguiente en un cycler termal:

Ligadura del adaptador

1. Proceda con la reacción de la ligadura cuanto antes después de la preparación del extremo.

2. Diluya el adaptador según el cuadro 1.

3. Prepare el sistema de reacción siguiente:

4. Vórtice suavemente y vuelta abajo brevemente a mezclarse bien, a centrifugar brevemente y para recoger todo el líquido a la parte inferior del tubo.

5. Realice la reacción siguiente en un cycler termal:

Solución recomendada para la limpieza de la polimerización en cadena/la selección de tamaño (el volumen magnético específico de la gota se debe ajustar según el tamaño de muestra real)

1. Prepare 100 productos de la ligadura del μl en un tubo de centrífuga apropiado.

2. Añada el μl 100 de las gotas magnéticas nuevas de la selección de la DNA a la muestra. Suavemente soplo con una pipeta durante 10 veces (o vórtice para 30 s). Incube las muestras para el minuto 5 en la temperatura ambiente.

3. Coloque el tubo en un estante magnético apropiado para separar las gotas del sobrenadante. Cuando la solución está clara, quitar y desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta (no deseche las gotas).

4. Añada el μl 200 del etanol recién preparado del 80% al tubo mientras que en el estante magnético. Incube en la temperatura ambiente para 30 s, y entonces quitar y desechar cuidadosamente el sobrenadante (no perturbe las gotas).

5. Repita el paso 4 una vez para un total de dos lavados.

Nota: Esté seguro de quitar todo el líquido visible después del segundo Washington.

6. El aire seca las gotas hasta que la superficie de las gotas magnéticas no tenga ningún lustre obvio mientras que el tubo está en el estante magnético con la tapa abierta.

Nota: Haga no overdry las gotas, ésta puede dar lugar a una recuperación más baja de la DNA. Cuando las gotas comienzan a agrietarse, son demasiado secas.

7. Quite el tubo del estante magnético. Añada el almacenador intermediario de la elución de 22 μl (Tris-ácido clorhídrico, pH8.0-8.5 10mM) al tubo. Mézclese bien midiendo con una pipeta arriba y abajo por lo menos de 10 veces o en un mezclador del vórtice para 30 el S. incuba para el minuto 3-5 en la temperatura ambiente.

8. Coloque el tubo en el estante magnético. Después del minuto 5 (o cuando la solución está clara), sobrenadante del μl de la transferencia 20 a un nuevo tubo. Se termina la selección, y la DNA seleccionada se puede utilizar para los experimentos subsiguientes o almacenar en -20°C durante mucho tiempo.

Amplificación de la biblioteca

1. Prepare la reacción siguiente en un tubo de la polimerización en cadena de 200 μl:

2. Vórtice suavemente y vuelta abajo brevemente a mezclarse bien, a centrifugar brevemente y para recoger todo el líquido a la parte inferior del tubo.

3. Realice la reacción siguiente en un cycler termal:

Solución recomendada para la limpieza de la polimerización en cadena/la selección de tamaño (el volumen magnético específico de la gota se debe ajustar según el tamaño de muestra real)

1. Prepare 50 productos de la ligadura del μl en un tubo de centrífuga apropiado.

2. Añada el μl 45 de las gotas magnéticas nuevas de la selección de la DNA a la muestra. Suavemente soplo con una pipeta durante 10 veces (o vórtice para 30 s). Incube las muestras para el minuto 5 en la temperatura ambiente.

3. Coloque el tubo en un estante magnético apropiado para separar las gotas del sobrenadante. Cuando la solución está clara, quitar y desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta (no deseche las gotas).

4. Añada el μl 200 del etanol recién preparado del 80% al tubo mientras que en el estante magnético. Incube en la temperatura ambiente para 30 s, y entonces quitar y desechar cuidadosamente el sobrenadante (no perturbe las gotas).

5. Repita el paso 4 una vez para un total de dos lavados.

Nota: Esté seguro de quitar todo el líquido visible después del segundo Washington.

6. El aire seca las gotas hasta que la superficie de las gotas magnéticas no tenga ningún lustre obvio mientras que el tubo está en el estante magnético con la tapa abierta.

Nota: Haga no overdry las gotas, ésta puede dar lugar a una recuperación más baja de la DNA. Cuando las gotas comienzan a agrietarse, son demasiado secas.

7. Quite el tubo del estante magnético. Añada el almacenador intermediario de la elución de 22 μl (Tris-ácido clorhídrico, pH8.0-8.5 10mM) al tubo. Mézclese bien midiendo con una pipeta arriba y abajo por lo menos de 10 veces o en un mezclador del vórtice para 30 el S. incuba para el minuto 3-5 en la temperatura ambiente.

8. Coloque el tubo en el estante magnético. Después del minuto 5 (o cuando la solución está clara), sobrenadante del μl de la transferencia 20 a un nuevo tubo. Se termina la selección, y la DNA seleccionada se puede almacenar en 2-8°C por 1-2 semanas o almacenar en -20°C durante mucho tiempo.

[Apéndice] esquema recomendado para la selección de doble cara

Si se requiere la selección doble-redonda, proporcionamos el esquema siguiente para seleccionar el volumen magnético apropiado de la gota según el tamaño previsto de la biblioteca. La selección de tamaño se puede realizar antes de la reparación del final o después de la amplificación. Una selección dos o doble-más redondos reducirá grandemente la producción de la biblioteca.

Llene el volumen de la biblioteca en la tabla abajo al μl 100. Seleccione el volumen de gotas magnéticas en dos rondas según el tamaño previsto de la biblioteca. Y realice la operación de la selección según las instrucciones siguientes.

Cantidad recomendada del cuadro 3 de gotas magnéticas para la selección Doble-redonda

1. Llene el volumen de la biblioteca al μl 100 en un tubo de la polimerización en cadena 200μl y etiquetado como A. Add cierto volumen de gotas magnéticas según el cuadro 3 (la ronda 1) al soplo de A. Gently del tubo con una pipeta para 30 S. incuba las muestras para el minuto 5 en la temperatura ambiente.

2. Coloque el tubo A en un estante magnético apropiado para separar las gotas del sobrenadante. Cuando la solución está clara, quite cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo y etiquételo como gotas de B. Discard.

3. Añada cierto volumen de gotas magnéticas según el cuadro 3 (la ronda 2) al soplo de B. Gently del tubo con una pipeta para 30 S. incuba las muestras para el minuto 5 en la temperatura ambiente. Coloque el tubo B en el estante magnético. Cuando la solución está clara, quitar y desechar cuidadosamente el sobrenadante.

4. Añada el μl 200 del etanol recién preparado del 80% al tubo B mientras que en el estante magnético. Incube en la temperatura ambiente para 30 s, y entonces quitar y desechar cuidadosamente el sobrenadante (no perturbe las gotas).

5. Repita el paso 6 una vez para un total de dos lavados.

Nota: Esté seguro de quitar todo el líquido visible después del segundo Washington.

6. El aire seca las gotas hasta que la superficie de las gotas magnéticas no tenga ningún lustre obvio mientras que el tubo B está en el estante magnético con la tapa abierta.

Nota: Haga no overdry las gotas, ésta puede dar lugar a una recuperación más baja de la DNA. Cuando las gotas comienzan a agrietarse, son demasiado secas.

7. Quite el tubo B del estante magnético. Añada el almacenador intermediario de la elución de 22 μl al tubo. Mézclese bien midiendo con una pipeta arriba y abajo por lo menos de 10 veces o en un mezclador del vórtice para 30 el S. incuba para el minuto 3-5 en la temperatura ambiente.

Nota: Si la captura apuntada no es realizada, añada el almacenador intermediario de la elución (Tris-ácido clorhídrico 10mM, pH 8.0-8.5) para la elución. Si no, el agua ultrapure esterilizada se debe utilizar para la elución.

• Tubo B del lugar en el estante magnético. Sobrenadante del μl de la transferencia 20 a un nuevo tubo.

Para el uso de la investigación solamente

 

GDSBio es una empresa de alta tecnología que se centra en la investigación y desarrollo, la producción y ventas de los productos de alta calidad de las ciencias de la vida. La compañía tiene una línea de productos completa, con tecnología de la polimerización en cadena como la base, centrándose en la polimerización en cadena general, almacenamiento cuantitativo de la polimerización en cadena de la fluorescencia, de NGS, electroforesis ácida nucléica y otras tecnologías de la biología molecular, y ha desarrollado los reactivo moleculares de la investigación, las materias primas de diagnóstico ines vitro moleculares, los reactivo de la extracción ácida nucléica y de la detección y otros productos.